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內容提要

研究供體-受體-供體(D-A-D)結構對熒光性質的影響機制對小分子NIR-II熒光團的設計具有重要意義。基于這種D-A-D結構，通過調節最高被占據分子軌道和最低未被占據分子軌道能級篩選吸電子或給電子基團和π橋基團，獲得NIR-II的熒光發射。以噻吩(T)、三苯胺(TPA)、9,9-二辛基芴(F)為電子供體，制備了系列以噻吩異靛藍(TIIG)、6,7-雙(4-己氧基苯基)-4,9-二(噻吩-2-基)-[1,2,5]噻二偶氮唑[3,4-g]喹惡啉(TTQ)為受體的D-p-D型NIR-II熒光團，其中TTQ-F的熒光強度最強，量子產率最高。為了實現NIR-II生物成像的應用，用PEG5k對具有理想NIR-II發射的TTQ-F進行了修飾，獲得了聚乙二醇化的NIR-II聚合物TTQ-F-PEG，實現了對小鼠血管、淋巴結、血管出血和胃腸道的體內NIR-II顯像。

前言

自從首次應用NIR-II(波長在1000 ~ 1700 nm)熒光成像以來，由于具有顯著的低光子散射、最小的自熒光、高空間分辨率以及低信號衰減，在生理過程的可是化方面顯示出了巨大的潛力。目前已經開發了各種具有足夠亮度的NIR-II熒光團用于分子成像，包括小型有機熒光團、量子點、單管碳納米管和稀土摻雜納米材料。由于有機NIR-II型熒光團具有生物相容性好、化學結構可設計、具有潛在的功能性等特點，是目前比較理想的熒光團。在有機NIR-II熒光團中，具有供體-受體-供體(D-A-D)結構的探針是在NIR-II窗口發射的典型小分子有機熒光團。6,7-雙(4-(己氧基)苯基)-4,9-二(噻吩-2-基)-[1,2,5]噻二偶氮并[3,4-g]喹惡啉(TTQ)和硫代異靛藍(TIIG)衍生物是典型的具有強吸電能力的共軛受體，它們具有可修飾的化學基團，可與不同的給電子體反應形成D-p-D型共軛分子。本研究以兩個強電子受體TTQ和TIIG為基礎，合成了8個NIR-II小分子。通過理論和實驗測試研究和分析了由不同電子給體和受體組成的上述小分子的吸收和發射特性。以TTQ為受體合成的四種小分子(TTQ-Xs)的吸收光譜與以TIIG為受體合成的四種小分子(TIIG-Xs)的吸收光譜相似，但熒光光譜存在顯著差異。TTQ-Xs的熒光強度明顯強于TIIG-Xs, TIIG-Xs幾乎沒有熒光。TTQ-F在TTQ-X分子中表現突出，熒光量子產率(QY)最高，光穩定性好。體內NIR-II熒光實驗表明，TTQ-F-PEG具有良好的NIR-II熒光性能。同時，LFP成像也顯示了TTQ-F-PEG具有高分辨率和高穩定性的良好成像性能。

結果與討論

如圖1所示，潛在的NIR-II小分子染料采用了具有TIIG或TTQ的高效D-A-D結構作為替代BBTD應用最廣泛的部分，其合成復雜，產率低。為了考察D部分的作用，選擇噻吩(T)、三苯胺(TPA)、9,9-二辛基-芴(F)和2-(9,9-二辛基-芴)噻吩(TF)作為D部分與A偶聯，得到8種小分子染料。上述小分子染料有兩個系列，分別定義為TIIG-Xs：TIIG-T、TIIG-TPA、TIIG-F、TIIG-TF和TTQ-Xs: TTQ-T、TTQ-TPA、TTQ-F、TTQ-TF(圖1)。利用密度泛函理論計算了這些小分子染料的最高占據分子軌道(HOMO)和最低未占據分子軌道(LUMO)表面預測這些小分子染料的光物理性質。圖1顯示了所有這些小分子染料的HOMO和LUMO波函數。所有HOMO都是沿著共軛主鏈離域的，而TTQ- Xs的LUMO主要定位在TTQ受體上，TIIG-Xs的LUMO分布更多地定位在D-A-D核上，表明TTQ-Xs降低了分子間相互作用的概率，有利于保持激發態能量。TTQ-Xs比TIIG-Xs具有更高的HOMO能級和更低的LUMO能級，從而保證了TTQ-Xs具有更低的帶隙。

圖1。D-p-D型小分子染料的合成與化學結構 /幾何優化后的小分子染料的HOMO和LUMO能級。

TTQ-TF的帶隙最小(1.79 eV和1.20 eV)，具有較低的帶隙，是NIR-II小分子染料的理想受體。如圖2a所示，TIIG-Xs有兩個吸收峰，TTQ-Xs有一個寬的吸收峰。這兩種不同的受體基染料的主要峰位置都在600-700 nm。在相同的給體的情況下，吸收峰的紅移。TTQ-Xs TIIG-Xs最大吸收峰如下：TIIG-T (633 nm), TTQ-T(644 nm), TIIG-F (637 nm), TTQ-F(655 nm), TIIG-TPA (653 nm), TTQ-TPA (687 nm),和TIIG-TF (672 nm) TTQ-TF(695 nm)。這一結果主要是由于上述TTQ-Xs具有更多的離域LUMOs和更低的帶隙。730 nm激發TIIG-Xs和808 nm激發TTQ-Xs的NIR-II熒光發射光譜。如圖2b所示，TIIG-XS在THF中測量的NIR-II發射信號較TTQ-Xs弱。特別是TIIG -TPA和TIIG-TF的最大熒光發射峰無法在NIR-II區域檢測到。這些結果表明TIIG-Xs不適合進一步的NIR-II成像應用。TTQ-Xs在THF中的發射光譜在1000 ~ 1100 nm處有發射峰，并在1300 nm處有發射峰，允許在NIR-II區域有高分辨率的熒光成像，其中TTQ-F的熒光強度最高，發射峰在983 nm, TTQ-TPA的熒光強度最低，發射峰在1036 nm。TTQ-F顯示發射QY最高的6.97%，大大高于TTQ-T(3.97%)、TTQ-TPA(3.0%)和TTQ-TF(3.37%)。此外，還比較了TTQ-Xs在THF中溶解后的1064 nm長通(LP)濾光片下的熒光和NIR-II熒光。顯然，TTQ-F在這些小分子染料中熒光信號最高，而TIIG-Xs化合物沒有信號(圖2c)。TTQ是構建具有較強NIR-II發射的D-p-D型小分子的最優受體，可用于進一步的NIR-II成像。

圖2。(a) THF中測量的小分子染料的吸收光譜和(b) NIR-II熒光發射光譜。(c)亮場圖像(左)和NIR-II熒光圖像(右，808 nm激光;1064 nm LP濾光片)的小分子染料。

為了實現水溶性NIR-II納米顆粒 TTQ-X@NPs，為進一步的成像應用，將NIR-II熒光性能的TTQ-X染料被封裝在一種商用兩親性三嵌段共聚物(Pluronic F127)中。這些TTQ基NPs在水相中的吸收和熒光光譜與在有機相中的相似。如圖3a所示，分別在TTQ-T@NPs、TTQ-TPA@NPs、TTQ-F@NPs、TTQ-TF@NPs的737、764、733、781 nm處有主要的吸收峰。在808 nm激光激發下，TTQ-X@NPs的NIR-II熒光發射光譜顯示出明顯的發射帶NIR-II地區。TTQ-T@ NPs、TTQ-TPA@NPs、TTQ-F@NPs和TTQ-TF@NPs的最大發射峰位于1059、1065、1060和1071 nm大(圖3b)，其中，TTQ-F@NPs的熒光強度最高，分別是TTQ-T@NPs、TTQ-TPA@NPs和TTQ-TF@NPs的1.9、3.3和3.5倍(圖3b)。進一步比較了1064 nm LP濾波器捕獲的這些水溶性NPs的NIR-II信號，結果與預期一致，TTQ-F@NPs顯示了最亮的NIR-II信號，這與熒光發射光譜的結果一致。

圖3。(a)水相測量的四種TTQ基NPs (TTQ-X@NPs)的吸收光譜和NIR-II熒光發射光譜。(c)用1064 nm濾光片過濾TTQ-X@NPs溶液管中的亮場圖像和NIR-II熒光圖像。所有這些數據都是在相同的質量濃度為0.1 mg mL^?1時測量的。

為了獲得更大的生物成像應用，我們選擇了具有良好NIR-II發射的TTQ-F，并進一步改進其水溶性。TTQ-F與氨基PEG快速反應，得到了水溶性NIR-II 熒光聚合物TTQ-F- PEG(圖4a)。TTQ-F-PEG在5 mg mL^?1的高濃度水溶液中具有良好的溶解性。采用動態光散射和透射電鏡(TEM)對水溶液中TTQ-F-PEG的粒徑和形貌進行表征(圖4b)。TTQ-F-PEG具有均勻分散的球結構，平均直徑為140 nm。作者研究了TTQ-F-PEG在固體或兩種介質(THF和水)中的紫外-可見-近紅外吸收光譜和熒光光譜。如圖4c所示，TTQ-F-PEG在THF、固體和水中分別在741、798和792 nm處有主要的吸收峰。與NPs類似，TTQ-F-PEG在固體和水中表現出更大的紅移吸收波長，而在THF中。TTQ-F-PEG在上述介質中同時用808 nm激光激發，記錄了其NIRII熒光發射光譜。如圖4d所示，TTQ-F-PEG在THF、固體和水中的主發射峰分別在1000、1093和1073 nm處檢測到。這些結果表明TTQ-F-PEG具有良好的體內外生物成像潛力。

圖4。(a) TTQ-F-PEG的化學結構和(b)粒徑分布。圖中為TTQ-F-PEG的透射電鏡圖像。(c)分別測定了TTQ-F-PEG在THF、固體和水中的吸收光譜和(d) NIR-II熒光發射光譜。

如圖5b所示，TTQ-F-PEG在THF中比在水中表現出更亮的NIR-II信號。TTQ-F-PEG功率顯示出與THF溶液相當的熒光。此外，獲得了在雞肉組織管中測量的NIR-II熒光圖像(圖5c)和軟件分析的不同深度(0、2、4、6和8 mm)的定量熒光強度，以表征穿透深度。TTQ-F-PEG在NIR-II窗口的穿透深度可達約8 mm。TTQ-F-PEG在7天內在水中表現出良好的尺寸穩定性。因此，TTQ-F-PEG是一種很有前途的NIR-II熒光團。在小鼠后肢和腹部血管1064 nm LP過濾器內，靜脈注射劑量為15 mg kg^?1的TTQ-F-PEG后，捕獲808 nm激發下的NIR-II熒光圖像。如圖5d?f所示，大腦、腹部和后肢的血管系統可以清晰地從周圍的背景組織中識別出來。此外，如圖5g?i所示，腦、腹、后肢血管半最大值全寬分別為0.48、0.68、0.48 mm。此外，體外細胞毒性實驗證實了TTQ-F-PEG的巨大安全性，即使劑量達到256 ug /mL，它對小鼠NIH3T3細胞的細胞毒性也可以忽略不計。因此，TTQ-F-PEG由于其較低的光子散射和較高的空間分辨率以及NIR-II光的信號衰減較低，因此具有良好的光學空間分辨率和對比度，從而具有較高的體內圖像質量。

圖5。(a) TTQ-F-PEG分別在四氫呋喃、固體和水的室內光和近紅外(NIR)光照射下的照片和熒光圖像。(c) TTQ-F-PEG在不同深度(0、2、4、6和8 mm)的NIR-II圖像。在TTQ-F-PEG (2 mg mL?1和150 μL)處理的小鼠的大腦(d)、腹部(e)和后肢(f)血管系統的NIR-II熒光圖像顯示了紅色實線和血管寬度分析的橫斷面熒光強度剖面圖(g、h和i)。

由于TTQ-F-PEG具有理想的體內NIR-II熒光性能，我們還利用這種四臂聚合物開展了NIR-II成像的其它應用。如圖6a、b所示，我們通過前足墊注射TTQ-FPEG，仰臥位和右側側臥位進行淋巴結顯像，可清晰顯示胸、臂淋巴結。此外，我們還成像了小鼠后肢的血管出血，這是多種疾病的并發癥。如圖6c、d所示，在仰臥位和俯臥位分別觀察到感興趣區域血管出血的NIR-II圖像清晰清晰。而未出血的另一側肢體未見出血的NIR-II信號。最后，利用NIR-II成像的深穿透深度優勢，成功實現了胃腸道成像。即使在注射后4h，在5mm深的位置，我們也能清楚地分辨出圖6e中的胃、大腸和回腸。解剖后，我們對健康小鼠的腸道器官也進行了成像。如圖6f所示，在胃、小腸、結腸和直腸中分別可以觀察到較強的NIR-II信號。這些成像應用表明，我們合成的四臂TTQ-F-PEG具有優異的NIR-II熒光性能。

圖6。前足墊注射TTQ-F-PEG允許NIR-II顯像(a)仰臥位胸廓淋巴結和(b)右側側位臂彎淋巴結。小鼠后肢血管出血的NIR-II FI分別為(c)仰臥位和(d)俯臥位。血管出血區域以紅色虛線為界。(e)健康小鼠通過口服TTQ-F-PEG的NIR-II胃腸道成像和(f)解剖后腸道器官的NIR-II 熒光成像。

由于TTQ-FPEG具有良好的NIR-II 熒光性能、良好的光學穩定性和低毒性，該小分子在LFP的開發中具有較高的分辨率、靈敏度和選擇性。TTQ-F-PEG可與淀粉混合形成TTQ-F-PEG/淀粉熒光粉，實現良好的流動性，實現指紋顯影。如圖7a、b所示，TTQ-F-PEG/淀粉的主要吸收峰和熒光峰出現在804和1103 nm左右，這與圖4c、d中TTQ-F-PEG固體的上述結果相似。TTQ-F-PEG/淀粉的NIR-II FI信號被1064 nm LP濾波器捕獲(圖7c)，這表明TTQ-F-PEG/starch具有開發LFP的巨大潛力。為了測試TTQ-F-PEG/淀粉型熒光粉的LFP檢測功能，我們選擇了塑料、錫箔紙和玻璃三種典型底物來評估其可行性。如圖7d所示，由于TTQ-F-PEG/淀粉引起的熒光信號在NIR-II窗口的高對比度，所有底物上都成功檢測到LFP。即使在儲存4周后，LFP的NIR-II熒光圖像仍然明亮清晰，說明TTQ-F-PEG/淀粉具有很高的穩定性(圖7e)。

圖7。(a) TTQ-F-PEG/淀粉的吸收和熒光發射光譜。(c) TTQ-F-PEG/淀粉分別在室內光和近紅外光下的照片和熒光圖像。(d)分別在NIR-II光照射下，在塑料基材、錫箔紙和玻璃上的TTQ-F/淀粉染色LFP的熒光照片。(e)上述TTQ-F/淀粉染色LFP樣品儲存4周后的熒光照片。

結論

作者合成了8個以TTQ和TIIG為受體，T、TPA、F、TF為供體的D-p-D型有機小分子。理論計算和實驗均證實TTQ作為較大的受體獲得了較長的NIR-II發射波長。此外,它是發現TTQ-F最亮NIR-II 熒光信號和優良的耐光性,因為紅移吸收/發射樂隊和顯著增強QY 6.97%的電子基效應造成的。TTQ-F經氨基聚乙二醇修飾后，在近紅外窗口獲得了一種吸收/發射波長為792/1073 nm的水溶性聚合物，可進一步準確成像小鼠血管、淋巴結、血管出血和胃腸道，分辨率高。TTQ-F-PEG/淀粉熒光粉可以改善LFP的開發和鑒定。不同底物上的熒光可以達到快速、靈敏的熒光效果。更重要的是，TTQ-F-PEG/淀粉的制備和LFPs的開發都比發煙法等傳統方法更簡單、更安全、更快。各種電子供體和基于TTQ受體的小分子NIR-II染料的設計帶來了新的意義，具有強大熒光信號的TTQ- F在進一步生物成像應用方面具有巨大的潛力。

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近紅外二區熒光染料