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內容提要

樹突狀細胞(DC)疫苗是一種有效的癌癥免疫治療策略，通過將抗原攜帶到樹突狀細胞中，并在接種后將樹突狀細胞移出引流淋巴結。本文報道了一種用于攝取抗原和激活樹突狀細胞的第二近紅外窗口(NIR-II)熒光納米顆粒。將卵清蛋白(OVA，一種免疫抗原) 通過靜電相互作用負載在聚賴氨酸(PLL) 修飾的NIR-II熒光納米顆粒的表面，表現(xiàn)出生物相容性和強的選擇性相互作用。這些載抗原復合物可被未成熟樹突狀細胞有效吞噬，誘導樹突狀細胞成熟并分泌細胞因子。皮下注射后，納米粒子高度敏感的NIR-II熒光信號表明，納米粒子標記的樹突狀細胞可以成功地在體內遷移到淋巴結，在癌癥免疫治療方面顯示了的巨大前景。

前言

**疫苗、過繼T細胞治療和免疫檢查點封鎖是近年來**免疫治療領域的三種主要方法，受到了廣泛關注。癌癥疫苗可以啟動免疫應答，誘導對癌細胞特異性抗原表達的保護性免疫。樹突狀細胞(DC)是最強的抗原呈遞細胞，在激發(fā)T細胞中起著關鍵作用。近年來，許多DC疫苗被開發(fā)用于癌癥免疫治療，活化的DC作為DC疫苗用于免疫治療來解決這些問題。在基于DC的免疫治療中，DC的有效性是關鍵，因此實時的DC跟蹤就顯得尤為重要。實時的體內DC成像可以為臨床治療中分析活化的DC如何遷移和改進治療方法提供有價值的數(shù)據。目前已經發(fā)明各種非侵入性追蹤系統(tǒng)來追蹤DC，包括熒光成像，磁共振成像(MRI)，正電子發(fā)射斷層掃描(PET)和閃爍成像。盡管DC跟蹤技術取得了很大的進展，但由于現(xiàn)有成像系統(tǒng)的局限性，在高靈敏度的體內精確計算DC的遷移仍然是一個挑戰(zhàn)。近年來，第二近紅外窗口(NIR-II)熒光成像(1000 - 1700 nm) 以較長的波長探測光子，可以減少光子在自身熒光較低的生物組織中的散射，實現(xiàn)更高的空間分辨率和更深的組織穿透，得到了廣泛的研究。有機分子材料因其良好的生物相容性和快速排泄能力而受到研究者的青睞。本研究作者開發(fā)了一種新的DC疫苗，具有體內NIR-II熒光跟蹤能力的抗原傳遞系統(tǒng)，合成了一種四臂聚合物TTQ- PLL，具有電子給體-受體(D-A)熒光核，產生NIR-II熒光信號。該聚合物負載雞蛋卵清蛋白(OV A)，可以有效結合OV A形成TTQ-PLL@OV A復合物。該復合物易于被樹突狀細胞攝取，并通過增強免疫因子分泌刺激標記樹突狀細胞達到更高的成熟水平。這種樹突狀細胞從腳掌到引流淋巴結的歸巢機制可以通過NIR-II熒光成像進行監(jiān)測，為基于NIR-II探針的免疫治療領域帶來了廣泛的興趣。

結果與討論

考慮到內涵體和溶酶體中存在蛋白酶，研究了TTQ-PLL在不同pH下的光學性質。TTQ-PLL顯示最大吸收約740 nm，NIR-II熒光發(fā)射在1050 nm。在808 nm激發(fā)下，TTQ-PLL pH值7.4的熒光強度略低于在pH值為5.0(圖1)，因此，TTQ-PLL具有在生理條件下具有良好的光學特性。在808 nm激光照射1 h后，熒光強度沒有明顯變化，具有良好的光穩(wěn)定性。根據pH 7.4和5.0下動態(tài)光散射的結果，TTQ-PLL的水動力粒徑分別約為44.2和41.7 nm(圖1c)。TEM圖像顯示TTQ-PLL的半徑約為40 nm (圖1d)。以IR1061為參考，測得TTQ-PLL的熒光QY為1.24%。TTQ-PLL可以作為NIR-II熒光探針進行進一步研究。如圖2e, f)所示， 0、1、4、6和8 mm雞乳肉組織下TTQ-PLL的NIR-II熒光圖像和強度結果表明，TTQ-PLL的NIR-II熒光信號的組織穿透率可達~6 mm。因此，這些數(shù)據表明TTQ-PLL可以作為一種NIRII熒光探針。

圖1。 (a) TTQ-PLL在pH 7.4和5.0下的紫外-可見吸收光譜，(b)熒光光譜和(c)水合動力學尺寸。(d) TTQ-PLL TEM圖像。(f) TTQ-PLL在0、1、2、4、6、8 nm處的NIR-II熒光強度。

將不同比例的OVA與TTQ-PLL混合10 min，在PBS中制備TTQ-PLL@OV A納米粒子，并利用FITC對OV A進行預標記以跟蹤這一過程。由于陽離子側鏈密度高，TTQ-PLL的負載率達到18.69%。通過TEM和DLS分析研究了配合物的形貌和尺寸，如圖2a, b所示。在pH 7.4和5.0條件下，TTQ-PLL@OV A復合物的水合動力粒徑分別為49和46 nm，TEM粒徑為45 nm。由于與OV A結合，TTQ-PLL@OV A的粒徑比結合前大。如圖2c所示，由于賴氨酸側鏈上的氨基，TTQ-PLL帶正電荷。將OV A與這些納米粒子混合后，Zeta電位顯著降低。圖2d顯示了不同pH值下OVA的釋放曲線。pH值為5.0時，8 h后OVA的釋放量為80%，而pH值為7.4時，8 h后OVA的釋放量僅為27.1%，這可能與PLL在酸性條件下的質子化有關。由于內涵體和溶酶體的酸性環(huán)境以及較低pH下OVA的快速釋放，TTQ-PLL可能在進入樹突狀細胞后釋放OVA，并被這些細胞作為抗原呈現(xiàn)。

圖2 (a) TTQ-PLL在pH 7.4和5.0下的水合動力學尺寸。(b) TTQ-PLL@OVA的TEM圖像(c) TTQ-PLL@OV A不同質量比時的Zeta勢。(d) OVA在不同pH值下TTQ-PLL的釋放。

為了研究TTQPLL@OV A的潛在應用，采用MTT法對其細胞毒性進行評價。因為生物可降解和生物相容的聚TTQ-PLL和TTQ-PLL@OVA對樹突細胞幾乎沒有細胞毒性，表明其具有良好的生物相容性，具有作為樹突細胞疫苗的潛力。為了研究細胞攝取，FITC標記OVA制備TTQ-PLL@OVA復合物，采用流式細胞術分析DC對FITC-OVA的攝取。DCs是分別處理OVA和TTQPLL@OVA復合物為0, 0.5, 1, 1.5, 2 h。TTQ-PLL@OV經處理的細胞顯示熒光強度明顯高于OVA 2 h后經處理的細胞治療,這表明TTQPLL@OV優(yōu)于OVA抗原遞送(如圖3 a和3b)。作者進一步采用NIR-II熒光成像技術研究了體外細胞攝取情況。用TTQPLL@OVA (QY=1.18%)孵育2 h后，捕獲DC的NIR-II熒光圖像。由于TTQ-PLL@OVA的攝取，TTQ-PLL@OVA孵育的DCs的NIR-II熒光信號顯著高于對照組 (圖3c, d)。因此，TTQ-PLL@OVA孵育的DCs適用于體內示蹤。

圖3。FITC-OVA， (b) TTQ-PLL@FITC-OV A孵育的DC中FITC標記OVA的變化。(c) NIR-II熒光圖像和(d) TTQPLL@OV A孵育后DC的強度。

DC成熟程度是DC免疫治療中反映免疫反應的重要指標，可通過檢測細胞膜上CD80+和CD86+的表達水平來確定。流式細胞術檢測不同實驗條件下樹突狀細胞CD80+和CD86+的表達水平，探討樹突狀細胞成熟水平。在圖4a中，培養(yǎng)后CD80+和CD86+的百分比均顯著增加TTQ-PLL@OVA。同時，OVA和TTQ-PLL處理的細胞中，成熟樹突狀細胞的比例從5.0%顯著增加到24.7%，而游離OVA和TTQ-PLL處理的細胞中，成熟樹突狀細胞的比例分別僅達到5.1%和8.2%。TTQ-PLL@OVA處理后，DC成熟水平顯著提高了約5倍。這些結果表明，DC成熟水平的提高可歸因于TTQ-PLL@OVA易于被DC吸收，最終導致更強的免疫應答。治療后釋放的細胞因子，如TNF-α和IL-1β，觸發(fā)了樹突狀細胞的成熟、活化和免疫刺激活性。本研究采用ELISA試劑盒檢測樹突狀細胞分泌TNF-α和IL-1β。如圖4b和4c，TTQ-PLL@OVA孵育的樹突狀細胞中TNF-α和IL-1β的分泌量遠遠高于無TTQ-PLL或OV A孵育的樹突狀細胞，TTQ-PLL可以釋放OV A誘導樹突狀細胞成熟并釋放細胞因子。因此，這些由TTQPLL@OV A激活的具有細胞因子分泌能力的成熟樹突狀細胞可以作為DC疫苗。

圖4。TTQ-PLL@OV A體外免疫調節(jié)活性。(a)流式細胞術檢測CD80+和CD86+表達。(b) TNF-α和(c) IL-1β的分泌通過ELISA法測定。

在基于樹突狀細胞的免疫治療中，活化樹突狀細胞遷移到引流淋巴結是基于DC的免疫治療的關鍵。高靈敏度的體內DC跟蹤是非常理想的，可以為臨床治療中改進治療方法提供有價值的信息。作者將TTQ-PLL@OVA和TTQ-PLL標記的樹突細胞分別注射到C57BL/6小鼠的左足墊，模擬遷移的進程。給藥后用NIR-II熒光成像系統(tǒng)檢測DCs的NIR-II熒光信號。在TTQPLL@OVA標記的樹突狀細胞注射后24 h，淋巴結內可見NIR-II熒光信號，48 h時該信號進一步增強，說明TTQPLL@OVA標記的樹突狀細胞從注射部位逐漸遷移到引流淋巴結(圖5a)。對DC注射側和TTQ-PLL@OVA標記的dc注射側淋巴結進行體外成像(圖7b, c)，證實了TTQ-PLL@OV A標記的樹突細胞可以有效地呈現(xiàn)抗原，并促進樹突細胞向局部淋巴結遷移。注射后14天后進行了(H&E)染色主要器官(心、肝、脾、肺和腎)的組織學檢查顯示TTQ-PLL@OV A標記dc具有良好的生物安全性。

圖5。(a) 通過足墊注射模型評估樹突狀細胞對局部淋巴結的靶向能力(紅色箭頭表示注射部位，紅線包圍的圓圈區(qū)域表示局部淋巴結)。(b)局部淋巴結歸巢成像和(c)標記樹突狀細胞處理后的平均熒光強度。

結論

作者合成了一種NIR-II熒光探針，該探針具有良好的水溶性、良好的光穩(wěn)定性和較強的載抗原能力，可用于OVA遞送系統(tǒng)。在負載該抗原后，TTQ-PLL@OVA可以有效地誘導樹突狀細胞成熟和細胞因子的釋放，還可以標記樹突狀細胞可作為樹突狀細胞疫苗，利用其固有的NIR-II熒光信號跟蹤DC在體內向淋巴結遷移的過程，對于了解刺激樹突狀細胞在基于樹突狀細胞的免疫治療中遷移和功能的細節(jié)具有重要的臨床意義。

參考文獻

Chao Wang, Bo Sun, Hui Bao, Tao Wang, Wenjuan Xu, Pengfei Sun*, Quli Fan*, Wei Huang, NIR-II probe modified by poly(L-lysine) with efficient ovalbumin

delivery for dendritic cell tracking, Sci. China Chem, 2020, 63, 1272-1280.

DOI：10.1007/s11426-020-9780-8.

https://link.springer.com/article/10.1007/s11426-020-9780-8

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