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內容提要

近紅外II光譜的熒光成像在組織成像方面具有很大的前景。作者通過在分子和形態水平上操縱扭曲的分子內電荷轉移和聚集誘導發射效應來探索有機NIR-IIb熒光團，研制了一種在NIR-II區可發射1600 nm的有機熒光染料，量子產率為11.5%。基于有機染料對活鼠血管和深層腸道進行NIR-IIb熒光成像，成像清晰度高，信號背景比增強，本研究能對有機NIR-IIb生物成像染料的發展具有啟發作用。

前言

在第二近紅外區域(NIR-II, 1000 – 1700 的熒光成像，由于進一步抑制光子散射和最小化的自熒光，使深層生物結構的直接可視化和實時反饋比NIR-I (800 - 900nm)更清晰。NIR-IIb (1500-1700 nm)熒光團的自熒光幾乎為零，光散射更低，可進一步提高成像的時空分辨率和穿透深度。量子點(QDs)、稀土摻雜納米粒子(RENPs)和單壁碳納米管(SWCNTs)等無機材料已經證明可以提高體內血管和**成像的分辨率。有機材料具有潛在的生物降解性、顯著的生物相容性和易于加工的優點，為NIR-IIb成像提供了相當大的前景。延長有機染料的共軛長度是一種被廣泛研究的紅移發射策略。當這些大型π共軛體系以生物有用的聚集態或納米粒子出現時，強烈的分子間π-π相互作用往往導致發射猝滅。利用分子工程電子給體(D)和受體(A)降低有機熒光團的最高已占據分子軌道(HOMO)和最低未占據分子軌道(LUMO)的能帶隙是另一種有效的紅移發射方法。一些具有扭曲D-A結構的熒光團表現出激發態電子轉移過程性質，即扭曲分子內電荷轉移(TICT)。利用TICT的優點，同時限制其非輻射衰變，可以獲得發光的有機熒光團，并將其發射擴展到NIR-IIb區域。在分子水平上，暗TICT態的形成依賴于D-A單元在分子內的靈活旋轉，這種運動有利于各種非輻射途徑產生微弱但長波長的發射(圖1a)。另一方面，通過限制分子內運動，可以獲得增強的熒光強度。聚集誘導發射(AIE)可以同時實現具有紅移發射和高量子產量(QY)的熒光團具有巨大的潛力。由于分子內運動(RIM)機制的限制，AIE發光原(AIEgens)在聚集時發出強烈的光(圖1b)。由于由多個分子轉子裝飾的扭曲結構，即使在聚集狀態下，AIEgens仍然可以在分子內移動，這傾向于進入暗TICT狀態。通過分子水平(TICT)和形態水平(聚集)的結構調制，可以同時獲得具有長波發射和高熒光QY的有機基納米粒子(圖1c)。作者設計了三個D-A型AIEgens，并將其發射擴展到NIR-IIb區域。采用強吸電子單元苯并二噻唑(BBTD)作為電子受體，三苯胺(TPA)作為供體和分子轉子來表征TICT的性質。在BBTD和TPA之間引入烷基噻吩，以保證共軛主鏈有較大的變形。2TT-oC26B的最大發射波長為~1030 nm，尾部延伸至1600 nm, QY高達11.5%。基于2TT-oC26B有機納米顆粒的NIR-IIb區域的熒光成像具有高分辨率和增強的信號-背景比(SBR)，可以實時清晰地顯示腸道的詳細結構，為內部器官成像提供了一個強大的平臺。

結果與討論

為了構建聚集態NIR-IIb發光的共軛AIEgens，分子設計包括三個要素：強D-A結構；可旋轉的單位；體積龐大的π共軛橋提供了一定的空間阻礙使分子具有扭曲構象。作者選擇BBTD作為強電子受體，烷基噻吩作為給體單位和π共軛橋。具有扭曲結構的TPA作為保證TICT狀態形成的分子轉子，同時作為第二供體單元促進電荷轉移。烷基鏈的位置和分子轉子對于確定熒光團的聚集發射是至關重要的。由于扭曲結構阻礙了強烈的分子間相互作用，與鄰位烷基鏈單元(鄰近BBTD)相結合的TPA分子轉子在納米顆粒中顯示出強烈的熒光(典型的AIE)。烷基鏈可以提供納米顆粒分子的空間隔離，促進分子內運動，這有利于形成暗TICT態。為了研究烷基鏈的影響，將直鏈己基(2TToC6B)、支鏈2-乙基己基(2TT-oC26B)和2辛基癸基(2TT-oC610B)接枝到噻吩的鄰位。分子設計的關鍵元素集中于采用第二碳支鏈的烷基鏈，因為它們提供了可調的空間位阻，不僅可以防止分子間相互作用，而且可以促進分子內運動。與具有線性己基的2TT-oC6B相比，具有支化2-乙基己基的2TT-oC26B的分子內運動具有更大的扭轉構象，而具有更多受阻的2-辛基癸基的2TToC610B的分子內運動空間最大。如圖1所示，噻吩與BBTD之間的大二面角(~50°)證實了鄰位烷基鏈的空間效應。圖    在分子水平上，這三個分子在四氫呋喃(THF)溶液中表現出典型的電荷轉移(CT)吸收帶，在~700 nm處，而它們的發射最大值位于NIR-II區域，為高清晰度的熒光成像提供了平臺。為了考察這三個分子在較高形態(聚集態)下的熒光性質，我們記錄了它們在不同水分數(fw)的THF/H_{混合物中的光致發光(PL)光譜。隨著水加入到THF中，2TT-oC26B的發射強度逐漸降低，直到fw= 40%，伴隨著紅移發射，表明了TICT特性的顯著溶劑化效應(圖3a)。為了支持聚集過程中TICT特性的存在，進一步向體系中加水，水的加入量從40%增加到90%}，的熒光強度顯著增強，這是由聚集體形成引發的RIM機制所致。在~1030 nm處的長波長峰表明2TT-oC26B聚集體的TICT特性仍然存在。同樣，2TT-oC6B和2TT-oC610B也具有TICT+ AIE特性(圖3b)。因此，主鏈(thiopheneBBTD-thiophene)扭曲和供體(TPA)扭曲的結合有利于TICT和AIE效應的共存，通過操縱分子內運動聚集了長波長發射(TICT)和強發射強度(AIE)的優勢。為了進一步在形態水平上研究熒光性質，作者使用生物相容性兩親共聚物(DSPE-PEG2000)作為摻雜基質，通過納米沉淀法將AIEgens制備成納米粒子(AIE NPs)(圖4a)。一方面，由于表面PEG降低了免疫識別能力，減少了蛋白質的吸附，使得AIEgens具有良好的膠體穩定性和良好的血液循環時間。另一方面，納米粒子觸發對分子內運動的調制，從而產生明亮的長波長發射。AIE NPs在NIR-II區域表現出發射，與它們的溶液態分布相似。它們的發射光譜甚至擴展到1600 nm(圖3c)，能夠進行NIR成像。這些AIE NPs的QY測定為11.5%，，。整個NIR-II地區(1000 - 1600 nm) 2 和2分別以IR-26為參考(圖3d)；而NIR-IIb區域(1500-1600 nm)的QY分別為0.12%、0.11%和0.09%。這些AIE NPs的吸收最大值位于730 nm，對深層組織激發和避免沒有光損傷 (圖3 e)。最重要的是，這些AIE NPs在連續激光照射下表現出良好的光穩定性(圖3f)。這些結果支持這些AIE NPs可以用于NIR-IIb熒光成像。

圖3。 在THF/水混合物中具有不同水組分(fw)的PL光譜。的三個分子的PL強度(I/I0)變化，其中I和I_{的PL強度最大。納米粒子的PL光譜。插圖:放大發射光譜在1500-1600 nm。三種化合物納米顆粒(1000-1600 nm)和IR26 (1050-1500 nm, QY=0.5%)在五種不同濃度下的熒光光譜圖。納米粒子的吸收光譜。連續輻照(110mw /cm^{下的吸收強度(A/A}圖，其中A和A分別為激光輻照前和后的最大吸收強度。}

    受2TT-oC26B NIR-IIb區域紅光和更高QY的啟發，評估了其NIR-IIb的體外成像能力。動態光散射(DLS)和透射電子顯微鏡(TEM)測量得到的2TT-oC26B NPs的直徑在60 nm左右，具有良好的水分散性和均勻的球狀結構(圖4b, c)。使用三種不同的長通濾波器(1100、1200和1500 nm)記錄了不同濃度(0.1、0.2、0.5 mg/mL)的2TT-oC26B NPs圖像(圖4e)。當用793 nm激光激發時，NPs在這三個窗口顯示出明亮的熒光。雖然在1500-1600 nm區域的QY僅為0.12%，但在NIR-IIb窗口可以觀察到強發射。為了進一步比較2TT-oC26B NPs在不同近紅外窗口的生物成像能力，將充滿2TToC26B NPs的毛細管浸泡在1%的脂質溶液中，在尖狀的phantom深度。即使在6 浸沒深度下，在NIR-IIb區域也能分辨出清晰的管邊界，但在NIR-I區域管邊界模糊不可見。盡管由于QY最高，最亮的圖像記錄在NIR-II區域，基于幾乎為零的自熒光和更低的光子散射的優勢，其SBR(1.8)和半峰寬的分辨率顯著低于NIR-IIb (SBR= 3.1和FWHM= 0.32 cm)。這些數據表明，2TT-oC26B NPs適用于NIR-IIb熒光成像。

圖為初始直徑。    熒光血管造影是一種將熒光探針注入血液的醫學策略，對循環系統和疾病診斷具有重要意義。為了進一步研究NIR成像的優勢，作者將2TT-oC26B NPs靜脈注射到小鼠血流中，使用不同LP濾光片(1100、1200和1500 nm)的InGaAs相機記錄其血管造影。靜脈注射2TT-oC26B NPs 10 min后，小鼠的整個血管網絡清晰可見(圖5)。與傳統的NIR-II成像(1100和1200 nm LP濾波器)相比，NIR-IIb成像在近似透明的背景下顯示出更高的分辨率(圖5a-c)。類似毛細血管的橫斷面強度(紅色圓圈)被繪制出來比較SBR。1500 nm LP的NIR-IIb窗的SBR為2.0，高于1200 nm LP的1.2和1100 nm LP的1.1，顯示了NIR-IIb成像的優勢。通過對所選區域的半寬測量，1100、1200和1500 nm LP的相似血管圖像的表觀寬度分別為0.58、0.56和0.41 mm(圖5d-f)，表明NIR-IIb成像具有最高的空間分辨率。特別是靠近肝臟的血管，1100和1200 nm LP不能清晰地看到，而1500 nm LP可以清晰地看到。高分辨率和低本底干擾為早期疾病提供更準確的診斷信息。

圖。   在Balb/c裸鼠體內靜脈注射2TT-oC26B NPs，進一步勾畫完整頭皮和顱骨的腦血管系統。清晰觀察到腦血管，分辨率~71.6μm(圖6a-c)。為了準確檢測精細的血管結構，作者還對大腦進行了高倍透顱顯微血管成像。如圖6d-f所示，可以明顯地看到小血管的表觀寬度只有10μm。這種高分辨率是由有機分子在NIR-IIb區域的低倍和高倍成像中實現的。2TT-oC26B NPs由于自身熒光顯著減少和光子散射最小化，表現出了高分辨率和高SBR的高性能NIR-IIb血管造影，在體內成像方面顯示出巨大的優勢。熒光成像的局限性之一是穿透深度，因此難以透視身體來監測胃腸道(GI)等內部軟組織，胃腸道疾病與糖尿病、甲狀腺疾病、結直腸癌等多種疾病相關。雖然磁共振成像(MRI)和計算機斷層掃描(CT)已被廣泛用于臨床診斷腸道疾病6，但有限的空間分辨率、較長的成像時間和有害的輻射風險限制了對腸道功能的監測。NIR-IIb成像由于其優越的時空分辨率，為實時監測腸道功能提供了平臺。因此，在口服2TT-oC26B NPs  后的不同時間點，使用不同的LP濾片(1100、1200和1500 nm)對腸道結構進行成像。如圖7a所示，分別在0.5、3、5、6 h灌胃后可看到回腸、盲腸、結腸和直腸。在1100 nm和1200 nm LP下均能檢測到組織，但圖像模糊，分辨率低。相比之下，在NIR-IIb區域，使用1500 nm的LP濾波器可以在背景可忽略的情況下區分清晰的組織特征分辨率。即使是腸道深處坐落在~ 5毫米深度,個人小腸憩室(~ 1毫米)也明顯歧視(圖7)。長波長成像的空間分辨率增強腸道的精細結構,顯著提高SBR(圖7 b, c)。同時，盲腸結構也可以在1500 nm LP減少曝光時間下清晰勾畫出來。在成像過程中可以清楚地監測腸的收縮功能。即使我們以大鼠為模型，其腸結構在約8 mm深度的NIR-IIb區域可以觀察到高清晰度的腸結構，而在NIR-I和NIR-II區域則很難區分。利用有機NIR-IIb探針可以在如此高的分辨率下監測小鼠和大鼠的微妙腸道結構。最后，在灌胃24 h后，2TT-oC26B NPs全部以糞便形式從體內排出，而不經腸道進入體內，有利于口服GI診斷造影劑的研制。因此，2TT-oC26B NPs可能是評估深層組織疾病的一個強大平臺。

圖沿

結論

作者展示了使用TICT和AIE聯合策略的純有機納米顆粒用于高質量的NIR-IIb熒光成像。分子設計的關鍵因素是骨干扭曲與扭曲分子轉子的結合，以調節聚集的分子運動和防止有害的分子間相互作用。在分子水平上，扭曲的NIR-IIb發射體更有利于分子內運動，從而形成TICT態。在形態水平上，分子聚集部分地限制了分子內運動，從而提高了熒光效率。由于具有多個轉子的扭曲三維結構，即使在聚集狀態下，AIEgens仍然保持分子內移動。因此，通過分子水平(TICT)和形態水平(聚集)的結構調節，有機NIR-II 納米顆粒同時具有紅移發射和高熒光QY。合成的2TT-oC26B NPs的發射光譜延伸至1600 nm，整個NIR-II (1000-1600 nm) QY為11.5%，NIR-IIb (1500-1600 nm) QY為0.12%，為NIR-IIb血管和腸道的高質量熒光成像提供了平臺，對進一步開發具有超長發射波長和高亮度的有機分子具有啟發作用。

參考文獻

Design of AIEgens for near-infrared IIb imaging through structural modulation at molecular and morphological levels,Yuanyuan Li, Zhaochong Cai, Shunjie Liu, Haoke Zhang, Sherman T.H. Wong, Jacky W.Y. Lam, Ryan T.K. Kwok, Jun Qian*,Ben Zhong Tang*, Nat. Commun., 2020, 11, 1255. DOI: 10.1038/s41467-020-15095-1.https://www.nature.com/articles/s41467-020-15095-1

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