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 內容提要

第二近紅外熒光成像(NIR-II FI)引導的NIR-II光熱療法(PTT)因其診斷準確，增強了對癌癥的治療效果，具有明顯的優勢。開發具有優異NIR-II熒光和PTT性能的共軛聚合物存在強的非輻射衰減、在有機溶液中的低溶解度和顯著的聚集引起的猝滅(ACQ)效應等問題，本文通過引入烷基側鏈修飾的雙噻吩(2TC)作為富電子給體單元，得到了在NIR-II區具有良好溶解度和強的NIR-II FI信號的共軛聚合物TTQ-2TC。由TTQ-2TC制備的水溶性納米顆粒(TTQ-2TC NPs)用于精確的NIR-II FI引導的NIR-II PTT治療。體內血液和**成像及治療表明TTQ-2TC NPs具有較高的信號-背景比(SBR)和NIR-II PTT良好的抗**療效。

前言

近年來，，光學成像引導的光熱治療(PTT) 由于其優越的診斷精度，是一種很有前途的抗癌治療策略。迄今為止報道的絕大多數PTT平臺都是基于近紅外第一光學窗口(NIR- I，750-900 nm)，其治療效果極大地限制在小的組織穿透深度和低的最大允許激光功率，如0.33 W cm ^{- 2}的808 nm)。因此，1064 nm波長的光作為PTT的光觸發器受到越來越多的關注，因為它在正常組織中穿透更深，并且NIR-II區域(1000~1700 nm波長)的最大允許激光功率(1 W cm^?2)。共軛聚合物(CPs)因其易修飾的化學結構、可定制的近紅外吸收、優越的光熱轉換和優良的生物相容性等諸多優點而受到人們的廣泛關注。在目前的光學成像方法中，無創NIR-II熒光成像(NIR-II FI，1000~1700 nm)具有較高的組織穿透深度(約5~20 mm)，在準確診斷癌癥方面具有巨大的潛力。盡管NIR-II PTT和NIR-II FI的結合為癌癥的更準確診斷和增強治療效果帶來了希望，但是具有優異的NIR-II PTT和NIR-II FI的共軛聚合物由于其在有機溶液中的低溶解度、顯著的聚集猝滅(ACQ)效應和強的非輻射衰減而使聚合物的熒光發射失活，因此對于滿足準確診斷和精確高效的癌癥治療的需求具有很高的價值。本論文以三唑[4,5-g]-喹啉(TTQ)為電子受體單位，長烷基側鏈修飾的雙噻吩(2TC)為電子給體單元，設計合成了一種新型共軛聚合物(TTQ-2TC)，優化的1064 nm波長吸收，強的NIR-II FI信號。利用TTQ-2TC制備了NIR-II FI/NIR-II PTT光治療納米顆粒(TTQ-2TC NPs)，具有良好的水分散性、良好的生物相容性、良好的光穩定性和**聚集性。TTQ-2TC NPs實現了后肢和腹部血管的高分辨率血管成像。TTQ-2TC NPs在1064 nm激光照射下可產生熱療效果，具有顯著的體外抗**療效。在體內**治療中證實TTQ-2TC NPs在NIR-II FI成像和NIR-II PTT納米醫學應用中具有很大的可行性。

結果與討論

獲得理想的聚合物具有吸收在1064 nm NIR-II PTT和NIR-II FI NIR-II有強烈的熒光，TTQ為吸電子單元， 2TC為給電子單元，實現高有機溶劑溶解度。該π共軛聚合物為TTQ-2TC通過Stille偶聯聚合。TTQ-2TC共聚物在氯仿、四氫呋喃(THF)、甲苯等常用有機溶劑中可以完全溶解(圖1b)。TTQ-2TC在600~1300 nm處顯示吸收帶，對應于D-A-D電荷轉移態的分子內電荷轉移(ICT)，在815 nm處的吸收峰較寬。吸收結果表明，該聚合物在1064 nm波長具有很強的吸收。采用808 nm激光激發， TTQ-2TC共聚物的主熒光發射峰位于1070 nm處，肩峰位于1270 nm處，量子產率(QY)測量為0.3%(在THF中以IR-1061標準)。TTQ-2TC THF溶液在不同濾波器(1064長通(LP)，1100?1200，1200?1300和1300?1400 nm)下的NIR-II FI(圖1c)。在所有的NIR-II濾波器中，甚至在1300 ~ 1400 nm的NIR-II區域都可以清晰地觀察到NIR-II成像信號。

圖1。(a)吸收和發射光譜;(b) TTQ-2TC溶液在THF中的照片;(c) TTQ-2TC在不同濾光片(1064 LP, 1000?1100,1100?1200,1200?1300和1300?1400 nm) THF (0.03 mg mL?1)中的NIR-II熒光成像;808nm激光為激發)。

作者利用兩親性共聚物PS - PEG負載TTQ-2TC通過超聲納米沉淀法。圖2a為TTQ-2TC NPs在水中的吸收光譜和發射光譜。TTQ-2TC NPs在700~1200 nm有較寬的吸收峰，吸收峰為880 nm。在808 nm激光照射下，TTQ-2TC NPs在1050 ~ 1400 nm表現出較強的NIR-II熒光，最大發射峰和肩發射峰分別出現在1270 nm和1135 nm處。TTQ-2TC NPs具有較高的量子產率(QY)，為0.03%。TTQ-2TC NPs溶液顏色為紅色(圖2b)， TTQ-2TC NPs的水動力直徑約為140 nm, PDI為0.13(圖2b)。TTQ-2TC NPs具有球形形貌，平均直徑為130 nm，透射電鏡(TEM)圖像(圖2c)。TTQ-2TC NPs在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)、FBS(含10%胎牛血清的溶液)和DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s培養基)中基本保持一致(圖2d)。考慮到TTQ-2TC NPs在水中具有高1064 nm的吸收(圖2a)，并且與之前報道的NIR-II光熱治療納米劑類似，TTQ-2TC NPs在1064 nm處的消光系數為6.2 L g^?1cm^?1(圖S6a)。TTQ-2TC NPs在1064 nm激光照射下具有良好的光熱轉換能力，在1064 nm激光照射360 s后，0.04和0.08 mg mL?1的TTQ-2TC NPs溶液分別從30°C和67°C增加，而在相同條件下的純水中，僅增加了2°C(如圖2e所示)。在1064 nm激光照射下，TTQ-2TC NPs的光熱轉換效率(η)為34.9%，反映了TTQ-2TC NPs在1064 nm激光照射下的優異光熱性能，具有作為PTT光熱劑的潛力。

圖2。(a)吸收和發射光譜；(b) TTQ-2TC NPs的水動力直徑。插圖：TTQ-2TC NPs熒光照片；(c) TTQ-2TC NPs的TEM；(d)不同介質中TTQ-2TC NPs；(e)不同濃度TTQ-2TC NPs在1064 nm (1.0 W cm^?2)激光照射360 s時溫度升高；(f)在恒定激光曝光(1064 nm, 1.0 W cm^?2)下TTQ-2TC NPs的光熱穩定性

TTQ-2TC NPs NPs與MDA-MB-231細胞系孵育24 h后，MTT測定TTQ-2TC NPs的體外細胞毒性，在沒有1064 nm激光照射的情況下，超過95%的細胞系存活，表明TTQ-2TC NPs在0.8 mg mL^?1內的細胞毒性可以忽略不計。TTQ-2TC NPs孵育4 h后，MDA-MB-231細胞中檢測到強烈的NIR-II圖像信號。為了評價TTQ-2TC NPs對MDA-MB-231細胞的光熱治療毒性，我們首先采用MTT法測定了MDA-MB-231細胞的活性。在1064 nm激光照射(5 min, 1.0 W cm^?2)后，隨著TTQ-2TC NPs濃度的增加，細胞活力明顯下降(如圖3a所示)。采用Calcein-AM/PI染料染色活細胞和死細胞，“TTQ-2TC NPs +激光”組可見明顯的紅色熒光，顯示大部分細胞壞死，TTQ2TC NPs對細胞有良好的PTT作用(圖3b)。所有對照組的細胞均呈現綠色熒光，說明TTQ-2TC NPs具有最佳的生物相容性，且1064 nm激光照射對細胞無損傷。

圖3。 (a)不同處理組的細胞存活率:不同濃度的TTQ-2TC NPs(黑色柱)或不(紅色柱)1064 nm激光照射5 min (1.0 W cm^?2);(b) calcein-AM/PI連體細胞CLSM圖像:沒有任何處理MDA-MB-231細胞，只有TTQ-2TC NPs或1064 nm激光照射(1.0 W cm^?2,5 min)處理細胞以及TTQ-2TC NPs和1064 nm照射處理細胞。比例尺: 50 μm。

在808 nm激光照射下，TTQ-2TC NPs可以在NIR-II區(900 ~ 1400 nm)發出強熒光。因此，選擇健康BALB/c小鼠進行TTQ-2TC NPs的體內NIR-II FI性能。BALB/c小鼠靜脈注射TTQ-2TC NPs (1.0 mg mL^?1,100 μL)后，獲得全身NIR-II顯像。在808 nm激光照射下，從周圍背景組織中可以清晰地觀察到小鼠的明亮腦血管，特別是腹部(圖4a,)。如圖4c, d所示。通過放大腦、后肢區域，量化主血管橫切面的熒光強度(以紅線表示)，腦、后肢血管成像的信號背景比(SBR)分別高達8和9.5。后肢和腹部血管寬度分別為0.29 mm和0.25 mm，證實了TTQ-2TC NPs具有高分辨率成像能力，是體內NIR-II成像的理想探針。

圖4。健康BALB/c小鼠注射TTQ-2TC NPs, 808 nm激光激發(1064 nm LP濾光片，100 ms曝光時間)后的NIR-II熒光圖像:(a)小鼠體脈管系統，(b)腹部，(c)大腦，(d)后肢。(e)腦血管和(f)后肢的SBR(信號-背景比)和橫斷面熒光強度剖面圖(根據紅色虛線)

為了進一步評價NIR-II FI在體內**中的作用，作者將TTQ-2TC NPs靜脈注射到皮下移植MDA-MB-231荷瘤小鼠體內。分別在靜脈注射TTQ2TC NPs前后1、4、8、12、24 h，獲得**NIR-II熒光圖像(圖5a)。注射TTQ-2TC NPs (1.0 mg mL^?1,100 μL)，**血管系統檢測到較強的NIR-II成像信號。在注射后4 h，**內部明亮的NIR-II成像信號開始逐漸增加，這表明TTQ2TC NPs由于增強的通透性和保留(EPR)作用而在**組織中積累。另外，在注射TTQ-2TC NPs 12 h后，**部分量化的NIR-II顯像信號不斷增強并上升至最高水平(圖5b)。這些結果表明TTQ-2TC NPs在NIR-II FI引導的NIR-II PTT中表現出被動靶向**的能力。為了評估TTQ-2TC NP在體內的分布，注射TTQ-2TC NPs 24小時后，解剖**和主要器官(肝、肺、脾、腎、心和腸)進行體外NIR-II FI，從這些離體NIR-II熒光圖像中，我們注意到清晰的NIR-II熒光信號主要見于**、肝臟和脾臟組織。說明TTQ-2TC NPs具有較強的EPR效應，可在**中積累，肝膽系統是NPs的主要代謝途徑。

圖5。MDA-MB-231荷瘤小鼠的體內NIR-II圖像和紅外熱圖像。(a)小鼠在靜脈注射TTQ-2TC NPs后1、4、8、12、24 h的NIR-II圖像(紅色點圈代表MDA-MB-231**區域)(808 nm激光激發，1064 nm LP濾光片激發，曝光時間為100 ms);(b) TTQ-2TC NPs注射后不同時間**NIR-II圖像的SBR;(c)經靜脈注射TTQ-2TC NPs或PBS, 1064 nm光照射(1.0 W cm?2)12 h后MDA-MB-231**小鼠的紅外熱像;(d)**區域相應的溫升軌跡與照射時間(MDA-MB-231**小鼠注射TTQ-2TC NPs或PBS)。

評價TTQ-2TC NPs在1064 nm光照射下對MDA-MB-231移植瘤小鼠體內NIR-II PTT作用。作者隨機將MDA-MB-231**異種移植小鼠分成四組(n = 6):一個PBS治療組(PBS) PBS和波長1064納米的激光照射治療組(PBS +激光),和一個只TTQ2TC NPs治療組(TTQ-2TC NPs)，以及TTQ-2TC NPs與波長1064納米的激光輻照治療組(TTQ-2TC NPs +激光)。注射TTQ-2TC NPs 12小時后，根據NIR-II熒光成像結果，NP積累達到最大值，因此皮下**用1064 nm激光照射(1.0 W cm^?2,10分鐘)。圖5c為紅外熱像儀拍攝的不同組小鼠經過不同治療后**溫度變化情況。**溫度迅速增加到53°C TTQ-2TC NPs +激光組照射5分鐘后,表明高光照轉換能力TTQ-2TC NPs在**內部,雖然PBS +激光組顯示只有一個微小的溫度變化在相同的激光條件下32°C。在不同的治療后，我們檢測**體積和小鼠體，以定量NIR-II PTT療效。1064 nm激光處理的PBS組和TTQ-2TC NPs組，**出現了急劇的生長趨勢(圖6a, b)。相反，1064 nm激光處理的TTQ-2TC NPs組，**完全被禁止生長。第14天，處死所有**小鼠，取MDA-MB-231**及其他主要組織(包括心、肺、脾、腎)進行蘇木精和伊紅染色分析(圖6c和7)。“TTQ-2TC NPs +激光”組**細胞明顯壞死，而其他三個對照組未觀察到明顯的組織病理學損傷。在NIR-II光熱治療下，TTQ-2TC NPs能有效地殺傷**。“TTQ-2TC NPs +激光”組小鼠的心、脾、肺、腎H&E染色(圖7)顯示主要組織的細胞結構無明顯變化。上述結果表明TTQ-2TC制劑具有生物安全性。

圖6。 (a)不同治療后MDA-MB-231異種移植瘤小鼠**體積隨時間變化曲線；(b) NIR-II PTT期末**照片；(c)不同治療小鼠**切片的H&E染色圖像。

結論

通過引入長烷基鏈修飾的電子給體2TC制備了一種新型共軛聚合物TTQ-2TC，該聚合物在有機溶劑中具有良好的溶解度，在NIR-II區具有優化的吸收，并具有明亮的NIR-II熒光信號。通過與兩親性共聚物PS - PEG的簡單納米沉淀法得到水溶性共軛聚合物納米顆粒(TTQ-2TC NPs)。TTQ2TC NPs具有良好的水分散性、高分辨率的血管成像質量、良好的光穩定性以及在1064 nm波長激光照射下優越的光熱效應TTQ-2TC NPs可以作為NIR-II FI引導的NIR-II PTT治療皮下移植MDA-MB-231**的有效光療探針。

參考文獻

Xingwen Song, Xiaomei Lu, Bo Sun, Hua Zhang, Pengfei Sun, Han Miao,* Quli Fan,* and Wei Huang, Conjugated Polymer Nanoparticles with Absorption beyond 1000 nm for NIR-II Fluorescence Imaging System Guided NIR-II Photothermal Therapy, ACS Appl. Polym. Mater. 2020, 2, 4171?4179. DOI:10.1021/acsapm.0c00637.

https://dx.doi.org/10.1021/acsapm.0c00637

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