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內容提要

光聲(PA)成像已經成為一種可靠的體內技術，用于從疾病篩選到分析傳感的各種生物醫學應用。大多數當代PA顯像劑采用NIR-I光(650 - 900 nm)來產生超聲信號，然而，內源性生物分子如血紅蛋白會產生明顯的干擾。向更長的激發波長(即NIR-II)過渡可以減少背景，促進低含量目標分子如NO)的檢測。作者采用開發了一種NIR II NO-響應探針APNO-1080，可用于深層組織PA成像。首先，作者進行了Hammett和Br?nsted分析，確定一種高度反應性和選擇性的苯胺基接受器，通過N-硝化化學與NO反應。在原位乳腺癌模型和異位肺癌模型中評估了APNO-1080在體內的深層組織成像能力。

前言

光聲(PA)成像是一種強大的體內技術，利用PA效應將吸收光轉換為超聲信號。由于臨床上相關頻率(2 ~ 18 MHz)的聲音可以在最小擾動下很容易地通過組織傳播，PA成像已成為各種生物醫學應用的通用方法。在分析物傳感的背景下，多種設計策略已被用于開發聲源探針(也稱為可活化PA探針)，以選擇性地可視化和監測體內不同的成像目標，如檢測缺氧、氧化還原狀態、酶活性、金屬離子、生物硫醇和各種活性氧和氮(ROS/RNS)的光聲探針。大多數小分子PA探針設計在NIR-I染料平臺上，其吸光度最大值在650 - 900 nm之間。一些內源性的生物分子如血紅蛋白、氧血紅蛋白、脂質和黑色素在這個區域吸收，導致高背景。除了不良的信號，這些生物發色團衰減入射光，從而限制靈敏度和成像深度。作者報道的第一代NIR光聲探針(APNO-5)和第二代NIR光聲探針(SR-APNO-3)，它們能在活鼠中檢測一氧化氮(NO)，但是均局限于炎癥和乳腺癌的皮下模型。在NIR-II區域(>1000 nm)吸收的PA探針可以克服這些限制，提高信噪比，提高靈敏度和更深的組織穿透。本文發展了APNO1080并用于深層組織NO的 NIR-II PA成像。

結果與討論

通過具有不同取代位的苯胺（對位分別是?Br，?H，?CH₂OH，?Et，?Me，?OEt和?OMe)與Cy7-Cl反應，獲得探針1?7(圖1a)。相應的Hammett圖顯示ρ值為?0.94，這與在過渡態積累的適度正電荷特征一致，這是由增加的電子密度促進的(圖1b)。從的Br?nsted圖中觀察到苯胺的共軛酸的pKa和反應的初始速率之間有很強的相關性(R²= 0.87，圖1c)。探針7在不到30秒的時間內促進了NO的接近完全轉化(25°C, 100等量)。作者將接收器連接在三個商用的NIR-II花菁(IR-26、IR-1061和IR-1048)以及Et-108032和FlavV7上合成了8?12個探針(圖1d)。該系列的每個化合物都有一個大的消光系數(約為10⁵M^?1cm^?1)，在近紅外II窗口中吸光度最大。但是，這并不是影響PA信號強度的唯一因素。探針8、9和12在緩沖溶液體系中都很難溶解，這導致了較弱的PA信號。探針10和11在水介質中具有清晰明確的光譜特性，并且在照射后具有明顯更強的PA信號。當NO過量時， 10和11反應完全。探針10(APNO-1080)能快速轉化為N-亞硝化產物，最大吸光度從874 nm轉移到1080 nm，紅移206 nm(圖2a)。APNO-1080及其N-亞硝化產物的連續輻照不會導致任何光氧化或光反硝化作用(圖2b)。作者首先檢測了APNO-1080 NIR-II光聲探針對NO的選擇性。在任何情況下，作者都沒有觀察到任何不希望的探針激活(圖2c)。此外，作者進行了一個標準的MTTA549細胞在25 μM濃度下培養24小時無細胞毒性(圖2d)。將APNO-1080與富含CYP450酶的大鼠肝微粒體(RLM)在37°C孵育1 h，檢測其代謝穩定性。APNO-1080在1080 nm處的吸光度沒有增加，說明有RLM存在時APNO-1080是穩定的。

圖1. (a)不同NIR-I APNOs(探針1?7)與NO反應生成N-亞硝基產物的示意圖。(b) 25℃下對取代APNOs和NO(引入為MAHMA-NONOate)的N-亞硝化反應的Hammett圖。虛線表示最佳線性擬合。R² = 0.94。(c) Br?nsted圖，表示log(k)與每個苯胺的共軛酸形式的pk_a值之間的線性關系。虛線表示最佳線性擬合。R² = 0.87。(d)來自IR-26、IR-1061、IR-1048、Et-1080和Flav7的NIR-II APNOs(探針8?12)的化學結構。

圖2. (a) APNO-1080經(紅色)和(藍色)NO處理后的歸一化吸收光譜。(b)的耐光性試驗APNO-1080或N-nitrosated產品(50 μM)連續與脈沖激光輻照在各自的最大吸收處300秒。(c)反應APNO-1080 (5 μM)與生物相關的金屬離子(1 mM),谷胱甘肽(1 mM),半胱氨酸(500 μM),硫化氫(100 μM)、活性氧(1 mM)，活性羰基 (1 mM)，活性氮(1 mM)，ONOO^?(50 μM)和NO (100 μM)孵育1 h后。(d) 37°C培養24 h后A549細胞毒性。

作者比較了APNO-1080和探針7(APNO-780)的深層組織能力。每個探針的溶液都用NO供體(MAHMA-NONOate)處理以確保完全激活。將得到的產品嵌入由瓊脂糖和2%牛奶組成的3厘米厚的模擬組織中，在吸光度最大處成像。APNO-1080可以清晰地觀測到，而APNO-780在背景中無法識別(圖3b)。當根據波長依賴性的影響差異進行校正時，相當于靈敏度增加了17.7倍(圖3c)。兩個探針的PA強度相似，表明激發光的穿透增加是導致靈敏度差異的原因。這是一個近似效果，因為模擬的組織缺乏血紅蛋白和氧血紅蛋白，活體中減弱NIR-I光比NIR-II光更明顯(圖3a)。

圖3. (a)與NIR-I光相比，NIR-II光能更深地穿透組織的示意圖。(b) APNO-780和APNO-1080代表性PA圖像(10 μM)經NO處理后，覆蓋3cm厚組織成像圖。(c)量化數據來自(b).誤差條= SD (n = 3)采用雙尾Student’s t檢驗(α = 0.05)進行統計分析。****: p < 0.0001。

檢測與癌癥相關的內源性NO對于理解其在調節**微環境中的作用至關重要。APNO-1080首次應用于原位4T1-Luc乳腺癌模型。與作者之前皮下乳腺癌模型相比，由此產生的原位**可以生長到體內更深處，是評估APNO-1080在體內深層組織成像能力的理想模型。表達熒光素酶的細胞系用來確認植入和跟蹤**生長。當**體積增長到約400 mm³時，給藥APNO-1080后對動物進行成像，并使用光譜分離來自探針的信號。作者觀察到荷瘤小鼠的激活反應為1.3±0.1倍，而無**對照小鼠的激活反應為1.0±0.2倍(圖4a,b,e)。我們將A549-Luc2肺癌細胞移植到Nu/J小鼠的肝臟上，模擬肺癌患者的肝轉移，并提供更深組織中成像NO的可能性。植入后幾周使用生物發光成像檢測**，然后通過眼球注射APNO-1080進行PA成像。30分鐘后進行實時PA監控，觀察到一個明顯信號增加**區域。

圖4. (a) (b)圖像橫斷面解剖的卡通示意圖。(b) 4T1-Luc**的代表性PA圖像，以及APNO-1080 (50 μM)治療后的無**對照。(c) (d) A549-Luc2**的代表性PA圖像，以及APNO-1080治療后的無瘤對照。(e) APNO-1080治療后4T1-Luc**的PA折疊正常化。(f) APNO-1080治療后A549**的歸一化PA折疊開啟(n = 6)和非**對照(n = 3)。錯誤條= SD。采用雙尾Student 's t檢驗(α = 0.05)進行統計學分析。***: p < 0.001

結論

作者成功地開發了第一個NIR-II光聲探針APNO-1080，用于檢測深層組織中內源性癌癥來源的NO。APNO-1080在NIR-II花菁平臺(IR-1048)上具有優化的對甲氧基苯胺接受器。與NO反應后，N-亞硝化產物的消光系數在1080nm處吸收最大，與探針的光譜無重疊，能夠靈敏地檢測**中穩定濃度在低nM范圍內的NO。本研究強調了將PA造影劑和光聲探針移至NIR-II窗口以獲得更大的成像深度和更高的靈敏度的價值。

參考文獻

Melissa Y. Lucero, Amanda K. East, Christopher J. Reinhardt, Adam C. Sedgwick, Shengzhang Su, Michael C. Lee, Jefferson Chan*, Development of NIR-II Photoacoustic Probes Tailored for Deep-Tissue Sensing of Nitric Oxide, J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 7196?7202， DOI：10.1021/jacs.1c03004. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c03004.

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NO近紅外1區/2區熒光/光聲探針