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熒光染料可對蛋白質、核酸和聚糖等其他結構進行染色，即便鈣離子等非生物物質也可以檢測出來。利用熒光物質與相應抗體或抗原發生特異性結合后，可對待測物進行定位、定性和定量的分析，此方法具有高度特異性、敏感性和直觀性，是最早出現的免疫標記技術。

當熒光物質吸收激發光的能量后，電子從基態躍遷到激發態，當其回復至基態時，以發射光形式釋放出能量，稱為熒光。其特點為在接受能量后即可引起發光，而一旦停止供能后，熒光隨之瞬間消失。

熒光素是最常見的熒光染料之一。與強堿反應生成熒光素鹽，易溶于水，并有強烈綠色熒光，熒光量子產率0.65（pH=7水溶液）。可使許多生物具有熒光的物質。它與ATP形成復合物（熒光素腺苷），然后再與熒光素酶(Luciferase)結合。

FITC:異硫氰酸熒光素(FITC) 是一種有機熒光染料，發射波長為520 nm的熒光染料，是目前最常用的熒光標志物；它的激發波長接近488 nm，光量子得率高，但受pH影響較大。目前，這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細胞術中。

在 495/517 nm 處，該染料會產生激發/發射峰值，并可借助異硫氰酸鹽反應基團與不同抗體結合，該基團可以和蛋白質上的氨基、巰基、咪唑、酪氨酰、羰基等基團相結合。而它的基本成分—— 熒光素，其摩爾質量為 332 g/mol，常被用作熒光示蹤劑。FITC(389 g/mol) 是用于熒光顯微鏡技術的首批染料，且其被當成 Alexa Fluor®488 等后續熒光染料的發端。該染料的熒光活性取決于它的大共軛芳香電子系統，而該系統受藍色光譜中的光所激發。

TRITC:四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸(TRITC) 是經常與 FITC 同時使用的另一種染料，由最大波長為 550nm的綠色光譜中的光所激發，其最大發射波長為 573 nm。TRITC (479 g/mol) 并非熒光素，而是羅丹明家族的衍生物，羅丹明也具有一個大的共軛芳香電子系統，正是該系統引發了它們的熒光行為。

雖然 FITC 和 TRITC 仍在使用，但由于它們屬于發光相對較弱的熒光染料且它們的優勢僅僅是經濟實惠，因此，在最新的顯微鏡技術中并不推薦。

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